溶菌酶配制triton_溶菌酶配制方法

溶菌酶配制triton_溶菌酶配制方法

       感谢大家参与这个关于溶菌酶配制triton的问题集合。作为一个对此领域有一定了解的人，我将以客观和全面的方式回答每个问题，并分享一些相关的研究成果和学术观点。

1.包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

2.质粒提取的基本原理

3.如何准确测定样品中蛋白质的含量

4.考马斯亮蓝测定蛋白质的原理是什么

5.考马斯亮蓝法测蛋白质含量是多少?

包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

       包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

       包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

       包涵体染色的方法有哪些？原理是什么

       蛋白包涵体-溶解原理及方法2009年03月15日；维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，；1.遵循标准；包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤；(1)快速溶解的动力学；；(2)与蛋白质的结合是可逆的；；(3)对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；；(4)对温度没有依赖作用；；(5)抑制蛋白质酶的降解作用；；(6)与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；；

       维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。先前有报道这种作用力是共价键结合的，但是，现在趋向于一致，就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。二硫键，无论是正确的还是错误的二硫键，在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质，溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分，当蛋白质被溶解以后，则进入到蛋白质的体外折叠的过程。

       1. 遵循标准

       包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本，必须遵循以下的标准：

       (1) 快速溶解的动力学；

       (2) 与蛋白质的结合是可逆的；

       (3) 对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；

       (4) 对温度没有依赖作用；

       (5) 抑制蛋白质酶的降解作用；

       (6) 与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；

       (7) 在可能的情况下，选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂，并适于以后的复性方法。

       2. 溶解包涵体的试剂

       最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。

       最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂，但是一般不用来大规模的生产，而是用来定性。除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外，其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。一旦蛋白质被溶解，蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键，然后这些蛋白质就不能再进行折叠。为了防止氧化，可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。

       （1）去垢剂

       去垢剂是一种最经济的溶解包涵体蛋白质的方法，一个最大的优点是溶解的蛋白质有可能保持全部的生物活性，说明在此条件下保持了蛋白质的四级结构。最重要的是稀释以后蛋白质的聚集比其它溶剂生成的很

       少。阳离子型、阴离子型的和非离子型的去垢剂都可以使用，使用时的浓度一般高于去垢剂的临界胶束浓度（CMC ），通常是0.5-5%。

       SDS仅仅在大量生产牛生长激素、干扰素和白介素-2中用到。SDS由于具有较低的临界胶束浓度（CMC）而使得结合到蛋白质分子上的SDS比较难于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用来溶解包涵体蛋白质并可用稀释的方法使蛋白质复性，残余的去垢剂可以使用阴离子交换色谱或者超滤的方法除去。这种去垢剂是一种比较温和的去垢剂，可以选择性地溶解一些包涵体，但是不能溶解完全的变性的蛋白质的聚集体和大肠杆菌的内膜的蛋白质分子。使用去垢剂一个主要的缺点是对以后的纯化和复性的步骤的干扰，去垢剂结合到蛋白质上的强度大离子交换色谱复性蛋白质小不同，比较难于除去，并干扰离子交换和疏水相互作用色谱的过程，在变性的浓度时超滤膜会吸附这些变性剂。所以复性后需要尽量洗涤这些去垢剂，也可以使用环状糊精链状糊精或者环状淀粉从复性缓冲液中提取去垢剂。

       一个不容忽视的问题是去垢剂可以溶解全部的膜蛋白质中的蛋白质酶，这些蛋白质酶的活性在去垢剂的存在的情况下被活化，可能造成溶解和复性过程的收率的降低。蛋白质复性的收率可以通过以下的方法来提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白质但是不溶解包涵体蛋白质的溶剂尽量洗涤包涵体蛋白质；

       b) 包涵体的含有的菌体碎片被完全除去；

       c) 溶解包涵体的液体中含有蛋白质酶的抑制剂，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF ）等 。

       （2）离液剂

       其它的离液剂也被用来溶解包涵体蛋白质，最主要的溶解包涵体蛋白质的离液剂是盐酸胍和尿素，这是最经常使用的溶解试剂，一般情况下选择6-8mo1/L的浓度，蛋白质浓度在1-10mg/mL。

       在溶解色氨酸合成酶A的过程，发现阳离子的溶解能力顺序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，阴离子的顺序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些离液剂由于它们的溶液比盐酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不适合用于溶解包涵体，因为利用离心和色谱分离起来比较困难。

       为了溶解包涵体蛋白质需要的尿素或者盐酸胍的浓度根据蛋白质的不同而不同。如果蛋白质天然形态需要溶解的变性剂的浓度不能获得，则在溶解包涵体时需要首先确定离液剂的浓度。

       盐酸胍由于比较贵，所以一般用来溶解一些附加值比较高的药物蛋白质分子，选择盐酸胍作为溶解试剂，是因为盐酸胍是一种比脲更为强烈的变性剂，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵体；尿素，由于可能被自发的形成的氰酸盐或者已有的氰酸盐的污染，特别是在碱性环境中，从而造成蛋白质的自由的氨基被不可逆的修饰。消除此种影响的方法是用阴离子的缓冲系统如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用阴离子交换色谱纯化，并且配制的溶解和复性的缓冲液在当天使用。脲溶液中影响蛋白质变性的因素与盐酸胍的不同。溶在脲中的蛋白质受到pH和离子强度的影响，从而影响电荷的蛋白质残基之间的电荷作用，但是由于盐酸胍含有高浓度的离子强度，所以这两个因素的影响很少。

       （3）混合溶剂

       一般情况下去垢剂并不联合使用，Lilly等人发现去垢剂和尿素的混合液有效的摩尔浓度较低。尿素和去垢

       剂型的盐混合可以使蛋白质变性，但是尿素和非去垢剂的盐如氯化钠反而降低包涵体蛋白质的溶解性，所以要避免使用。

       去垢剂结合其他的试剂或者溶解增强剂也被使用，发现尿素和乙酸，尿素和二甲亚枫，尿素和高pH等是比较有效的溶解包涵体蛋白质的方法。

       高压（1-2kbar）、超声也可以溶解包涵体蛋白质，此时使用的溶解试剂浓度可以比较低，便于后续的复性步骤。

       3. 极端pH

       酸碱度也是比较廉价的有效的溶解包涵体的方法。最经常使用酸的是有机酸，浓度在5-80%之间。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高温（85℃ ）溶解抗真菌的重组蛋白质的肤段，低温和高PH需要溶解时间要长。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一种麦芽糖结合的蛋白质。但是，同样的一些不可逆的修饰作用或者酸降解会在极端pH下发生，所以此种方法并不是经常使用的溶解包涵体的方法。

       高pH（≥12）也被用来溶解生长激素和原胰岛素。在高pH下一些蛋白质同样可能发生非可逆的变性，原因在于半胱氨酸在碱性条件下的脱硫过程。所以这种方法尽管比较简单、廉价，同样仅仅用于一些特定的蛋白质，特别对于药用蛋白质一般不采用这种方法。

       再登陆/content/20050415/10541.htm

       摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质折叠以及复性技术的进一步应用提供依据。

       关键词 重组蛋白 包涵体 复性 二硫键

       到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90%以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难，即这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1~3.0μm的固体颗粒[1]。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。

       包涵体形成的原因

       重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。

       1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

       2、 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

       3、 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

       4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

       5、 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

       减少包涵体形成的策略

       1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。

       2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。

       3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

       包涵体的分离及溶解

       对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。

       包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。

       蛋白质的折叠机理

       包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳

       状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争[1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的具体步骤可用下式描述[12、13、14]：

       伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体

       在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。

       提高重组蛋白质折叠复性的方法

       一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。

       1、 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大[16]。

       2、 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。

       3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定

质粒提取的基本原理

       蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

如何准确测定样品中蛋白质的含量

       质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。

       实验原理

       提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。

       碱裂解法

       人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

       尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

       在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

       煮沸法

       煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。

       质粒小提试剂盒

       用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

考马斯亮蓝测定蛋白质的原理是什么

       5种方法测定蛋白质含量

       一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

       样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

       二、双缩脲法（biuret法）?

       1、实验原理

       双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。?

       紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。?

       此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

       2、试剂与器材?

       （1）试剂：a、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

       如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配制，酪蛋白用0.05n nach配制。?

       b、双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

       （2）器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

       3、操作方法

       （1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

       用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

       （2）样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。?

       三、folin—酚试剂法（lowry法）?

       1、实验原理?

       这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

       这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

       在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

       对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

       浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

       含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。?

       进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

       此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

       2、试剂与器材

       （1）试剂

       a、试剂甲： （a）10克碳酸钠，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 。溶解于500毫升蒸馏水中。 （b）0.5克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。?

       b、试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，

       开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈**（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准nach滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。?

       c、标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。?

       （2）器材?

       a、可见光分光光度计?

       b、旋涡混合器?

       c、秒表?

       d、试管16支?

       3、操作方法

       （1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，

       然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

       这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。?

       注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

       全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

       每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

       folin—酚试剂法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）?

       蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）?

       （2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

       通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。?

       根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。?

       注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

       四、改良的简易folin—酚试剂法?

       1、试剂?

       （1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

       （2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

       （3）标准蛋白质溶液：同基本法。?

       2、操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。

       用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。?

       五、考马斯亮兰法（bradford法）?

       1、实验原理 双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。?

       1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

       这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

       经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

       2、试剂与器材?

       （1）试剂：?

       a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

       b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

       （2）器材：?

       a、可见光分光光度计?

       b、旋涡混合器?

       c、试管16支?

       3、操作方法

       （1）标准方法?

       a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

       最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。?

       b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。?

       注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。?

       考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)?

       蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （a595）?

       c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。?

       （2）微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量是多少?

       考马斯亮蓝测定蛋白质的原理是染料结合法。

       在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465nm变为595nm，同时颜色也由棕色变为蓝色，该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。

       在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm。当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

操作流程：

       该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

       1、Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

       2、标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

       3、将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

       4、按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

       5、每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。

       6、根据标准曲线计算待测样本的浓度。

       考马斯亮蓝法测蛋白质含量是0～1 000μg/mL。

       考马斯亮蓝一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

       测定含量：

       该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果，如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。

       浓染液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000mL，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

       样本准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之间绘制标准曲线。

       溶解：将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

       稀释：按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

       作用：每个样本加5mL稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。

       计算：根据标准曲线计算待测样本的浓度。

       好了，关于“溶菌酶配制triton”的讨论到此结束。希望大家能够更深入地了解“溶菌酶配制triton”，并从我的解答中获得一些启示。